METTL3增强了人和小鼠中p53介导的肿瘤抑制

编码p53蛋白的TP53基因在半数以上的人类癌症中发生突变，反映了其作为肿瘤抑制因子的基本作用。p53作为一种转录因子，能够应对细胞应激，如DNA损伤和致癌信号，以驱动与组织稳态和肿瘤抑制相关的抗增殖或促凋亡反应。p53作为一种转录激活因子，对控制限制肿瘤发生的基因表达程序至关重要。尽管p53的转录激活功能在肿瘤抑制中的作用已经得到证实，但p53调控下游基因表达程序的机制尚不清楚。完全理解p53调节基因表达的机制对于临床最终靶向这一关键的肿瘤抑制因子至关重要。

p53通过与辅助因子相互作用来促进特定的基因表达程序，以增加转录起始水平。p53还招募组蛋白修饰酶，以乙酰化组蛋白和重塑染色质。然而，p53调控基因表达的机制除了对转录起始的影响，目前还不太清楚。最近也有研究表明p53在其他水平的基因调控中起作用，阐明p53活性的其他方面将为了解p53在组织内稳态和癌症抑制中的功能提供关键的见解。

近些年的研究已经阐明了RNA修饰在基因表达调控中的重要性。具体来说，N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA中最丰富和最普遍的内部修饰，主要通过METTL3-METTL14甲基转移酶写蛋白（writer）复合物协同转录安装在mRNA上。根据研究内容和特定环境下表达的m6A阅读器（reader），m6A修饰可以通过影响RNA稳定性、亚细胞定位和翻译来影响基因表达。重要的是，m6A修饰已被证明对细胞状态转变至关重要，例如在干细胞分化过程中以及对各种应激信号（包括DNA损伤或热休克）的响应中。然而，控制哪些转录本被选择m6A修饰来驱动特定细胞反应的因素仍然是个谜。

首先利用串联亲和纯化/质谱发现了与p53相互作用的多个蛋白，包括METTL3。继而利用免疫共沉淀和免疫印迹实验证实了p53和METTL3的相互作用（图1A-C）。在p53缺失的人或小鼠细胞中共同表达p53和METTL3后，注意到METTL3可以提高p53蛋白水平，提示METTL3可能会影响p53功能。而Mettl3缺失导致p53在应对DNA损伤（阿霉素，dox）时积累减少，伴随着各种p53靶基因的诱导减少，表明METTL3增强了p53蛋白的积累和转录活性。

图1 METTL3与p53相互作用并增强了p53蛋白积累

在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）模型中Mettl3敲低导致DNA损伤处理后（dox）p53积累减少。通过RNA-seq发现很多非经典的p53靶基因在Mettl3敲低后显著下调（图2D），对这些基因进行功能注释能够富集到p53通路（图2E，F）。事实上，对已知与p53结合并在MEFs特异调控的基因表达的分析证实了Mettl3敲低折中了DNA损伤诱导的表达，而不是这些基因的基础表达（图2G）。

图2 METTL3促进p53转录程序响应DNA损伤

为了探究METTL3在p53通路上依赖催化活性的作用，通过m6A-eCLIP-seq实验确定了p53靶基因转录本在DNA损伤处理后显示出METTL3依赖的m6A修饰（图3），包括已知的p53靶基因（Neat1，Ptp4a3，Killer，Mdm2）和肿瘤抑制相关靶基因（Tex15，Sulf2，Polk，Slc19a2）。利用ChIP实验证实了METTL3可与p53靶基因染色质结合，直接进行m6A修饰，而这一作用在p53缺失时减弱，表明p53对于METTL3招募这些位点的重要性。这些研究结果表明METTL3对p53具有双重作用，主要是通过稳定p53，其次是通过p53通路中选定的转录本m6A修饰来增强它们的表达。

图3 DNA损伤下METTL3介导的p53靶基因转录本m6A修饰

为了确定METTL3是否也参与p53的抑癌功能，在小鼠MEFs模型中减弱METTL3蛋白表达增强细胞克隆潜能，敲低Mettl3都能显著增强p53野生型MEFs的体内肿瘤生长。另外，利用原发的小鼠肺腺癌模型结合CRISPR-Cas9基因编辑技术证实了Mettl3和Mettl14在体内肺腺癌中均有抑癌活性，其中p53在抑癌中有已经确定的作用（图4）。

图4 在小鼠模型中，METTL3支持p53介导的肿瘤抑制

最后，研究人员利用TCGA数据探讨了p53-METTL3相互作用在人类癌症发展中的作用。在多个癌种中发现甲基转移酶复合物（MTC）与TP53呈现一种相互排斥的突变模式，这表明当MTC的成分发生突变时，突变TP53的选择压力较小。进一步分析也证实MTC是p53通路中的一种成分。

这项研究发现METTL3是一种新型的p53相互作用分子，在两个水平上增强p53活性中起着基础性作用。METTL3的主要作用是通过与p53的氨基末端结合，通过催化活性无关的机制来延长其半衰期。METTL3还可以通过在急性DNA损伤反应和肿瘤抑制中，在选定p53靶基因转录本上安装m6A修饰来促进p53活性，以确保它们的有效表达。