小RNA大功能！piRNA竟也调控m6A RNA甲基化！

原创上海天昊生物

近日苏州大学基础医学与生物科学学院庄文卓教授及苏大附属第二医院血液科李炳宗教授合作在Blood上发文报道“piRNA-30473通过调控m6A RNA甲基化促进弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的肿瘤发生及不良预后”。

DLBCL是最常见的淋巴恶性肿瘤亚型，在临床表现、形态和生物学方面具有异质性。基因表达谱已经鉴定出其三种分子亚型，包括生发中心B细胞(GCB)样DLBCL、激活B细胞 (ABC)样DLBCL和未分类的第三种DLBCL，其中ABC样DLBCL的生存期往往较差。因此，基于分子致癌机制的进一步研究对于改善预后分层和产生新的治疗策略是必要的。m6A修饰水平的改变介导细胞凋亡、增殖、自我更新和发展。然而，m6A RNA甲基化在DLBCL进展中的潜在作用尚不清楚。与Piwi蛋白相作用的RNA（piRNAs）占据小非编码RNA的主要部分，一些证据表明piRNAs参与多种肿瘤发生。然而，piRNAs在DLBCL表观转录调控中的作用机制需要进一步研究。

作者首先聚焦在DLBCL的FFPE样本研究小RNAs的表达水平，芯片检测了6例DLBCL患者发现了4个piRNAs在预后良好组（FP）比预后不良组（PP）显著上调或下调（图1A）。继而在42例DLBCL患者中对这4个piRNAs的表达水平进行qPCR验证，发现piRNA-30473水平在不良预后组中显著增加，而其它3个piRNAs没有显示出显著差异（图1B）。Kaplan-Meier分析DLBCL患者高水平的piRNA-30473与不良的OS相关（图1C）。

为了研究piRNA-30473在DLBCL中的功能，作者在DLBCL细胞中利用antagomir-30473敲除piRNA-30473，发现细胞增殖下降（图2A）。细胞周期分析发现抑制piRNA-30473提高G1期细胞比例，降低S期和G2期细胞比例（图2B-C），但是并未诱导细胞凋亡（图2D）。另外，在SU-DHL-8移植瘤DLBCL模型中（图2E），抑制piRNA-30473导致肿瘤体积显著减小（图2F）。这些数据表明沉默piRNA-30473能够在体内外有效抑制DLBCL细胞活性。

由piRNAs诱导的异常DNA甲基化是肿瘤的一个标志，然而piRNAs在m6A RNA甲基化修饰中的作用却无从知晓。为了研究piRNA-30473在DLBCL表观转录组调控中的潜在功能，研究人员对DLBCL细胞转染antagomir-30473后检测m6A总体修饰水平，结果发现m6A修饰显著降低（图3A-B）。考虑到m6A甲基转移酶或去甲基化酶对修饰水平的影响，进而检测m6A调控因子的表达水平，发现沉默piRNA-30473后显著降低了WTAP的mRNA和蛋白水平，而其它蛋白的水平并未发生显著的变化（图3C）。另外，免疫组化结果显示antagomir-30473处理后降低了移植瘤模型中WTAP的表达（图3D）。WTAP介导了METTL3和METTL14招募靶标mRNA，免疫沉淀结果显示抑制piRNA-30473后降低了WTAP和METTL3/METTL14之间的联系（图3E）。

亚细胞定位发现piRNA-30473在核内和细胞质中均有分布，利用miRanda分析piRNA-30473是否与WTAP有可能的结合位点（图3F），并利用荧光素酶报告基因实验对该结合位点进行了验证（图3G）。敲低piRNA-30473后WTAP mRNA稳定性也下降了（图3H），因此，piRNA-30473能够减少WTAP mRNA的衰退，通过结合到WTAP 3’UTR区域增强其稳定性。基于这些结果，可以总结出piRNA-30473在DLBCL中对于维持WTAP的表达和功能是必需的。

为了研究WTAP在DLBCL中的功能，免疫组化显示WTAP在预后不良患者中呈现高表达（图4A），而且利用GEO数据分析显示高表达的WTAP也预示着不良预后（图4B）。敲低WTAP后显示出与敲低piRNA-30473相似的影响：m6A总体水平下降，细胞增长被抑制，细胞周期停滞，并且没有明显的凋亡（图4C-F）。挽救实验表明抑制piRNA-30473可以被WTAP过表达rescue。因此，这些研究结果证实了WTAP作为piRNA-30473功能上重要的靶点在DLBCL中发挥着“致癌”的角色。

为了研究WTAP介导的m6A甲基化在DLBCL细胞中的影响，科研人员对SU-DHL-8 WTAP缺陷型细胞和对照细胞进行m6A测序分析。与已发表文章类似，DRACH motif富集在纯化的RNA中（图5A），m6A位点主要富集在外显子和3’UTR区，更高地富集在终止密码子附近（图5B）。通过对甲基化修饰的peak和差异表达基因的筛选，发现了136个潜在的靶基因（图5C）。利用多个GEO数据集分析WTAP和这些基因的表达相关性，发现HK2（在DLBCL缺氧时对于其生长促进是需要的）与WTAP在所有数据集中呈现高度相关性。GSEA分析WTAP潜在靶点发现主要富集在低氧特征相关的信号通路中（图5D），表明HK2在DLBCL中的确是WTAP的一个关键靶点。

WTAP敲低时，HK2转录本5’UTR区m6A水平显著下降（图5E）。为了证实m6A测序和RNA测序结果，在WTAP缺陷细胞中利用m6A qPCR和qPCR验证了HK2水平（图5F-G）。荧光素酶报告基因实验则证实了WTAP通过介导m6A修饰位点对HK2的影响（图5H），而m6A修饰位点的缺失同样能够逆转WTAP介导的表型的影响（图5I-J），因此这些结果确认了WTAP/HK2在DLBCL中的功能机制。

为了确定IGF2BPs是否影响了HK2的表达，在IGF2BPs敲低的细胞中检测HK2的表达，qPCR结果证实IGF2BP2缺陷的细胞中HK2转录本水平显著下降（图6A），稳定性实验也证实了HK2趋向于不稳定（图6B）。荧光素酶报告载体实验说明了m6A修饰位点对于IGF2BP2识别HK2的重要性（图6C）。因此，RNA结合蛋白IGF2BP2从功能上与WTAP协同影响着DLBCL细胞中HK2 mRNA的稳定性及表达。

天昊生物具有多年基因组、转录组和表观组等多组学检测与分析的经验，m6A RNA甲基化作为表观领域的一大热点，天昊生物自主设计了m6A调控因子（writers/erasers/readers）差异表达分析检测panel，还可以提供m6A修饰整体水平定量检测，并结合MeRIP-seq和RNA-seq挖掘受m6A调控因子影响的下游靶点，同时可对相关的靶点进行MeRIP-qPCR验证。生信团队亦可提供个性化的m6A数据库挖掘与生信分析内容。

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