定制液相芯片富集测序技术-上海天昊生物-微生物绝对定量测序、宏基因组测序、甲基化检测、单细胞转录组测序、转录组测序、外泌体检测

定制液相芯片富集测序技术

技术简介：

目标区域测序（Targeted Sequencing）：是指针对感兴趣的目标区域富集后进行大规模测序。研究者可以针对自己感兴趣的染色体区域或者大量的候选基因区域进行数百个甚至上千个样品的序列测定。目前，天昊生物提供4种目标区域富集方法：定制液相芯片富集、 Long-PCR富集、FastTarget富集和EasyTarget ?富集。

定制液相芯片富集

该富集方法利用商业Agilent SureSeclect 液相芯片富集捕获系统，设计定制研究目标区域的相关捕获探针，通过探针与样品片段化DNA的杂交和富集，将捕获之后洗涤获得的目标区域片段进行文库构建，并进行扩增后利用Illumina Hiseq 高通量二代测序系统进行PE150的测序，对所获得测序数据进行生物信息学的读取、质控及分析，寻找研究感兴趣的序列及序列差异。该方法非常适合100kb-12Mb区域的多个候选基因外显子或连续区域富集二代测序项目。

应用领域：

     • a)候选基因突变筛查
     • b)复杂疾病关联分析
     • c)临床疾病诊断

技术优势：

     • a)针对性强：比起全基因组水平的研究，目标区域测序更具有针对性，可以依赖大量的前期研究成果，获得候选染色体区域或者基于生物通路的大量候选基因。
     • b)费用低：目标区域测序区域较小，可对数百个样品进行快速测序，大大降低了研究成本。
     • c)信息量大：比起目标区域或者候选基因单倍型标签SNP分型的研究策略，目标区域测序可以完整覆盖整个基因区域，不仅可以获得高频SNP的分型数据，而且还可以发现低频的和个体特有的变异。
     • d)效率高：比起使用Sanger法的候选基因测序方法，基于二代测序技术的目标区域测序更加快速、高效。
     • e)高精度：目标区域的高测序深度保证了更准确的测序结果，例如目标区域测序的测序深度可以达到200×。

技术路线：

服务特色

技术参数

富集方法	样本要求	测序策略	数据要求
定制液相芯片富集	样本类型：完整无污染的基因组DNA；样本浓度：浓度>=50ng/µL. 样本纯度：OD 260/280介于1.8-2.0，OD260/230 ≥2.0；样品需求量：总量>2μg；	Illumina 2X150	? 对于通过质控所有样本，提供测序原始数据，样本的下机原始数据总测序深度平均达到 200×，碱基 Q30 比例 >80%； 90% 以上的样本目标区域平均测序深度 > 50×，且这些样本测序深度达到 10× 的碱基比例 > 90%。以上数据标准不适用于位于或包含高 GC 区域。

数据分析流程

基本分析内容	原始数据整理、质量评估序列过滤、统计富集效率比对到目的区域 SNV/InDel/CNV检测，注释，统计
高级分析内容
单基因病分析内容	突变位点过滤（数据库过滤，匹配正常样本过滤）依据家系信息进行遗传模式分析候选致病基因功能注释候选致病基因通路富集分析基于家系连锁分析纯合区域策略分析
复杂疾病分析内容	突变位点过滤（数据库过滤，匹配正常样本过滤）依据家系信息进行遗传模式分析常见变异的关联分析罕见变异的基因负荷检验候选致病基因功能注释候选致病基因通路富集分析
肿瘤分析内容	Somatic SNV/InDel/CNV检测，注释，统计不同阶段样本突变谱差异统计高频突变基因统计驱动基因统计分析
天昊特色分析内容	天昊二代测序数据验证试剂盒完成96个SNP分型，分析与二代测序结果的一致性

客户文章解读

单位	参考文献	主要内容
北京大学首都儿科研究所教学医院	Miao, C., et al., Mutations in the Motile Cilia Gene DNAAF1 Are Associated with Neural Tube Defects in Humans. G3 Genesgenetics, 2016. 6(10): p. 3307-3316.	候选基因的突变筛查

英文题目：Mutations in the Motile Cilia Gene DNAAF1 Are Associated with Neural Tube Defects in Humans

中文题目：纤毛相关基因DNAAF1的突变与人类神经管缺陷有关

发表时间：2016年10月

研究背景：

神经管缺陷（NTD）是由复杂的遗传和环境因素引起的中枢神经系统的严重畸形。在涉及NTD的基因中，纤毛相关基因的贡献已经非常明确，已经明确这些基因对完成神经管闭合（NTC）是必需的。

研究方法：

我们对373个NTD患者和222个健康对照进行了新一代靶向测序，测序靶基因包括BBS4, CEP290, DNAAF1, IFT172, INTU, MKS1, 和IQCB1的蛋白编码区和调控保守区。

研究结果：

我们发现纤毛相关基因DNAAF1中的8种疾病特异性罕见突变。 DNAAF1在不同的动力蛋白-臂复合物的细胞质预组装中起重要作用，并且在一些参与神经系统发育的关键组织中表达，例如神经管，底板，胚胎节和斑马鱼，小鼠的室管膜上皮细胞。因此，我们评估了转染细胞中DNAAF1突变体的表达和功能，以分析这些突变体与人类NTDs的潜在相关性。与野生型相比，罕见移码突变（p.Gln341Argfs * 10）导致DNAAF1蛋白表达显著减少。另一种突变p.Lys231Gln在细胞试验中破坏了动力蛋白 - 臂复合物的细胞质预组装。此外，对来自NTD样品的mRNA的NanoString测定结果表明，DNAAF1突变体改变了NTC相关基因的表达水平。

研究结论:

这些研究结果表明，DNAAF1中罕见突变可能导致人类对NTDs的易感性。

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